Técnicas laboratoriales en el diagnóstico del complejo entérico porcino
Héctor Puente
Gerente de la unidad de diagnóstico y autovacunas (UDAVET)
Aunque no es imprescindible conocer en detalle el funcionamiento de un laboratorio de diagnóstico, es esencial contar con cierta información sobre las técnicas utilizadas. Esto resulta clave para interpretar correctamente los resultados y facilita una mayor conexión entre el trabajo del veterinario de campo y el del especialista en diagnóstico de laboratorio.
En términos generales, estas técnicas se pueden clasificar en tres grandes categorías:
Cultivo microbiológico
El aislamiento o cultivo microbiológico de microorganismos presentes en las heces y/o contenido intestinal es útil para el diagnóstico directo de ciertas infecciones entéricas de origen bacteriano. Sin embargo, esta técnica no es eficaz como herramienta de diagnóstico rutinario para infecciones de origen viral ni, en general, para aquellas causadas por patógenos intracelulares. Debido a la alta concentración de bacterias en este tipo de muestras, es necesario utilizar medios selectivos y diferenciales para el aislamiento e identificación de enteropatógenos. Los medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo específico de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de otros, mientras que los medios diferenciales revelan características particulares de ciertos microorganismos, facilitando así su identificación o diferenciación
La identificación definitiva de los microorganismos aislados se puede llevar a cabo utilizando diversas técnicas, como métodos bioquímicos o pruebas moleculares, entre las cuales destaca la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En los últimos años, especialmente en laboratorios más especializados, ha ganado importancia el uso de la espectrometría de masas MALDI-TOF. Este método genera un espectro característico de cada microorganismo y, mediante la comparación con amplias bases de datos, permite identificar los aislados bacterianos a nivel de género y especie.
Técnicas moleculares
Las técnicas moleculares se basan en la especificidad de las secuencias de ácidos nucleicos, siendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la más utilizada para el diagnóstico de infecciones del complejo entérico. Existen dos variantes principales: la PCR convencional y la PCR cuantitativa (qPCR).
El proceso comienza con la extracción y purificación del ADN o ARN de la muestra, generalmente utilizando kits comerciales que separan los ácidos nucleicos de otros componentes celulares. A continuación, se lleva a cabo la reacción de amplificación, en la que se dispensan la muestra de ácido nucleico extraído, los cebadores, los desoxinucleótidos, la ADN polimerasa y la solución tampón. Esta amplificación se realiza en un equipo de PCR o termociclador donde se reproducen entre 25 y 40 ciclos de desnaturalización, anillamiento y elongación, con diferentes temperaturas y tiempos:
- La desnaturalización, a 94-96ºC, separa de las hebras del ADN para obtener dos cadenas separadas que servirán de molde
- La hibridación o anillamiento, a 45-65ºC, permite la unión específica de los cebadores a la secuencia específica.
- La extensión o elongación, a 72ºC, permite la síntesis de una nueva cadena, añadiendo nucleótidos complementarios a la hebra molde mediante la acción de la enzima polimerasa.
En la PCR convencional la detección del fragmento de ácido nucleico amplificado se realiza al terminar la reacción, sobre un gel de agarosa. En cambio, en la qPCR (PCR cuantitativa), la detección se realiza durante la propia reacción, a través de la medida de la fluorescencia emitida por una sonda que hibrida, de forma específica (sondas TaqMan) o inespecífica (SYBR Green), con el fragmento amplificado.
El valor de Ct o umbral de ciclo en la qPCR es el ciclo a partir del cual este incremento de fluorescencia pasa de ser lineal a exponencial. Este valor junto con la realización de una curva patrón puede permitir extrapolar la concentración de ácido nucleico en la muestra de origen.
Técnicas inmunológicas
Las pruebas inmunológicas se fundamentan en la especificidad de la interacción entre antígeno y anticuerpo. Estas pruebas incluyen técnicas directas, cuyo objetivo es identificar antígenos del agente etiológico, y técnicas indirectas, orientadas a detectar anticuerpos específicos contra dicho agente.
Las principales técnicas inmunológicas empleadas en el diagnóstico del complejo entérico son:
a) Inmunocromatografía
- Pruebas rápidas y sencillas que no requieren equipamiento ni personal especializado.
- Ofrecen resultados cualitativos.
b) Inmunohistoquímica
• Requiere el uso de un microscopio.
• Es una prueba más compleja que necesita laboratorios especializados en histopatología.
• Se basa en muestras de tejidos de alta calidad y buena conservación.
c) ELISA
- Necesita un lector de absorbancia.
- Es una prueba automatizable y objetiva que se realiza en condiciones de laboratorio.
- Proporciona resultados cuantitativos o semicuantitativos.
En los próximos capítulos hablaremos de forma individual de los principales agentes enteropatogénicos en porcino
Referencias
Carvajal, A., Argüello, H. y Rubio, P. (2021) Control de procesos digestivos en cebo. 1.a ed. Zaragoza: Grupo Asís Biomedia.
Carvajal, A., Rubio, P., Argüello, H., Gómez Laguna, J. y Miranda Hevia, R. (2018) Diarrea neonatal. 1.a ed. Zaragoza: Grupo Asís Biomedia.
Carvajal, A., Argüello, H. y Puente, H. (2024) Análisis de diarreas en porcino. 1.a ed. Zaragoza: Grupo Asís Biomedia.
